抑制BRAF可防止听力损失(多图）

介绍

全球七百万人患有不同听力损失（度1，2）。顺铂化疗导致听力40不敌癌症患者和阻碍的语言能力在年轻个体（发展60％的3 - 5）。在现代社会中，由于噪声暴露水平的不断提高，由噪声引起的听力损失正变得越来越突出。尽管进行了广泛的研究，但迄今为止，还没有获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物来防止噪音，顺铂，抗生素或与年龄有关的听力损失。大多数候选在临床前和临床试验目前化合物与抗氧化剂，维生素，炎症和代谢谷胱甘肽，如硫代硫酸钠（STS），Ñ乙酰半胱氨酸，D -甲硫氨酸，和地塞米松（1，2，6）。例如，STS是顺铂的直接灭活剂和抗氧化剂，在顺铂化疗后6小时给药，成功地将局限性标准风险性肝母细胞瘤患儿的听力损失发生率降低了48％，但降低了已治疗的散播患者的生存率肿瘤（7 – 9）。类固醇地塞米松已被证明可用于治疗耳毒性噪声（只是部分有效10，11）。

我们通过开发一个不带偏见，表型的高通量筛选（HTS），以确定小分子发起的这项工作，对铂毒性（提供保护12，13）。蛋白激酶是特别有吸引力的治疗靶标，因为它们调节关键的细胞功能，许多激酶抑制剂已被FDA批准用于人类治疗，因此，作为听力损失的治疗剂具有巨大潜力。蛋白激酶磷酸化级联调节体内所有细胞类型中的主要信号转导途径。因此，抑制这些途径也可能影响内耳中的关键信号转导途径。使用源自小鼠耳蜗的永生细胞系，并在模仿非有丝分裂细胞生长的缓慢生长条件下培养（不含γ-干扰素的HEI-OC1）（14），我们以剂量反应模式筛选了162种激酶抑制剂，并确定了命中率最高的达拉非尼（TAFINLAR）。达布拉非尼是一种有效的选择性BRAF激酶小分子抑制剂，可口服生物利用并获得FDA批准，用于治疗多种具有激活的BRAF的癌症（BRAF V600E或V600K突变），例如黑色素瘤，小细胞肺癌，甲状腺和胆道癌（15 – 18）。

BRAF是Raf丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的成员。它在RAS / RAF / MEK [有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）激酶] / ERK（细胞外信号调节激酶）信号转导途径（也称为MAPK信号级联的一部分）中起重要作用，并参与细胞增殖和细胞存活（19）。此途径在人类癌症（大约三分之一失调20，21）。BRAF的磷酸化激活的MEK蛋白，这反过来，激活该磷酸化多种底物包括核转录因子（下游ERK蛋白激酶22，23）。BRAF在小鼠内耳起始在胚胎18.5天（E18.5）检测，并在有丝分裂后耳蜗毛细胞（HCS）和支持细胞（SC）（检测24，25）。先前已经报道了磷酸-ERK的表达是上调在机械和噪声损伤（小鼠内耳26 - 28），并且可以是蜂窝信号，其感测细胞损伤和触发器细胞死亡。因此，抑制BRAF的耳毒性损害可以揭示该信号通路在有丝分裂后耳蜗细胞中的新作用。

重新使用FDA批准的药物最近已成为药物开发中一种特别有吸引力且有效的替代方法，并且几种抗癌药物被用于新的医学适应症（29）。与新的化学实体（10到15年且超过20亿美元）相比，重新用途的药物具有较短的开发时间（5至8年），上市成本降低40％（https://ncats.nih.gov/preclinical/重新用途）。基于达布拉非尼在人类使用中的大量信息，可以将其快速应用于人类的听力保护和治疗临床试验。达拉非尼作为一种具有耳保护作用的治疗药物具有几个明显的优势：（i）达拉非尼是经FDA批准的口服药物，无疑是在普通人群中给药的最便捷途径，并且已经被批准用于人类口服。我们可以在此处测试听力保护范围内的剂量。（ⅱ）Dabrafenib穿透血-脑屏障（30，31），其类似于血-迷路屏障（32）。这种穿越血液迷宫屏障的独特性能克服了听力障碍药物开发的主要障碍之一。（iii）达拉非尼已开发为抗癌药（16 – 18）本身并不太可能是抗氧化剂化合物，因此在某些类型的肿瘤中具有不干扰甚至协同顺铂杀死肿瘤的功效的潜力。（iv）达拉非尼在听力保护和治疗领域影响着一种新的生物学靶标BRAF激酶途径。鉴于对BRAF / MEK / ERK途径的特定和有效抑制剂作为抗癌药的研究很多，因此在此途径和其他途径中使用多种激酶抑制剂的联合治疗可以在更低，更低毒性的剂量下提供更好的保护。Dabrafenib（BRAF抑制剂）和trametinib（MEK抑制剂）的联合治疗目前用于黑色素瘤和非小细胞肺癌的治疗，并且比单独dabrafenib更有效地抑制该途径（18，33）。以前，我们已经确定CDK2抑制剂作为候选治疗剂为听力损失（13，34）。因此，达拉非尼和AZD5438（CDK2抑制剂）的组合可提供更好的抗耳毒性功效，并降低一般毒性。

在这里，我们首先验证了dabrafenib和三种其他的BRAF抑制剂，两种MEK1 / 2抑制剂以及一种ERK1 / 2特异性抑制剂在顺铂诱导的小鼠耳蜗外植体中的毒性，并测试了dabrafenib单独或dabrafenib联合AZD5438预防顺铂的功效-以及在成年小鼠模型中经口传递时产生的噪声引起的听力损失。我们的研究结果表明，当顺铂和噪声侵害时，BRAF激酶以及BRAF / MEK / ERK和CDK2通路在应激激活和诱导有丝分裂后耳蜗细胞凋亡中的关键作用。这种早期的磷酸化级联反应在耳蜗SC中被激活，并被BRAF / MEK / ERK激酶的小分子抑制剂所减弱。

结果

达布拉非尼在小分子激酶抑制剂筛选中名列前茅

针对顺铂耳毒性（保护性化合物的无偏屏幕12，13）用的是永生化的内耳细胞系HEI-OC1从小鼠耳蜗（派生进行14）。以剂量反应模式筛选了一百六十二种独特的小分子激酶特异性抑制剂，以保护免受50μM顺铂的伤害。使用一种方案量化caspase-3 / 7活性测定法，以测量凋亡，该方案可量化源自caspase-3 / 7底物裂解的发光产物（Caspase-Glo 3/7试剂）。单独使用顺铂处理的细胞定义为100％的发光，未处理的细胞定义为0％的发光（图1A，图S1，表S1和补充材料中的数据集）。

图1 在细胞系和人工耳蜗外植体模型中，达布拉非尼可防止顺铂诱导的细胞死亡。

（A）使用HEI-OC1细胞系以剂量-反应模式进行基于细胞的小分子筛选；命中定义为在50μM顺铂存在下可使caspase-3 / 7活性降低50％或更多的化合物。单独使用培养基（绿点），单独使用顺铂（红色点）和化合物+顺铂（灰色点）。（B）在存在50μM顺铂的情况下，来自caspase-3 / 7分析的达拉非尼剂量反应曲线（A）（蓝色），以及单独的HEI-OC1细胞中达拉非尼的细胞滴度-Glo剂量反应曲线（红色）。（C）达布拉非尼的分子结构。（D）dabrafenib（Dab）在经或未经顺铂处理的P3 FVB小鼠耳蜗外植体中的剂量反应。在将顺铂（150μM）加入治疗24小时（紫色）的P3 FVB耳蜗外植体之前1小时，添加单独的培养基（黑色），单独的顺铂（白色），单独的Dab（绿色）或Dab。每个条中的数字表示每次处理计数的外植体数量。用鬼笔环肽染色计数每160μm耳蜗中转区域的外毛细胞（OHC）数量，与单独的顺铂（红色）和单独的培养基相比，平均值±SEM，** P<0.01，*** P <0.001 （黑色）通过Bonferroni事后检验进行单向方差分析（ANOVA）。（E）显示了用单独的介质，60μMDab，150μM顺铂或3μMDab和150μM顺铂处理24小时后的鬼笔环肽染色的整装中途转向人工耳蜗外植体的典型共聚焦图像。

通过Cell Titer-Glo细胞活力测定法进一步表征所有化合物，以确定单独的化合物在HEI-OC1细胞中的毒性（表S1和补充材料中的数据集）。热门产品包括四种BRAF特异性抑制剂：甲磺酸达拉非尼，维拉非尼，PLX-4720和RAF-265。在所测试的化合物中，选择达布拉非尼作进一步表征是因为它具有口服生物利用度，FDA批准用于治疗转移性黑色素瘤和间变性甲状腺癌，EU批准用于非小细胞肺癌，因为它可以穿越血脑屏障（15 - 18，35，36）。达拉非尼在中位抑制浓度下显示出对顺铂诱导的细胞死亡的保护作用（IC 50）在caspase-3 / 7分析中为13.47μM），并且在细胞活力分析中测试的所有浓度下对HEI-OC1细胞无毒（图1，B和C）。其他BRAF抑制剂在微摩尔范围内的IC 50相似，并且对细胞无毒（表S1）。

达布拉非尼和其他MAPK抑制剂可防止顺铂诱导的小鼠耳蜗外植体HC死亡

小鼠人工耳蜗外植体被广泛认为是体内人工耳蜗模型的替代品，并且对于实用的药物筛查是实用的（37）。接下来，我们使用经过dabrafenib预处理1小时，然后进行24小时150μM顺铂处理的P3-P4 FVB小鼠耳蜗外植体来表征dabrafenib的保护作用，并计算每160μm存活的外部HC（OHC）的数量。单独使用中药，单独使用药物和单独使用顺铂作为对照。剂量反应实验表明，达拉非尼具有保护作用，IC 50为30 nM，中位致死剂量（LD 50）> 60μM，治疗指数（TI）定义为LD 50 / IC 50，> 2000（图1，D和E; 请参阅“材料和方法”中的“耳蜗外植体”部分，以比较外植体和细胞系中的IC 50 s。

接下来，我们试图通过测试额外的打击最大的激酶特异性抑制剂来保护顺铂诱导的耳蜗外植体细胞死亡，以进一步验证BRAF和MAPK信号级联反应是否为我们的目标。在经典的MAPK级联反应中，BRAF直接磷酸化并激活MEK，而MEK进而磷酸化并激活ERK（图2A）（38）。其他三个BRAF抑制剂威罗菲尼（39），PLX-4720（40），和RAF-265（41，42）显著减轻顺铂诱导的OHC损失与IC 50 / TI的200纳米/ 15.0，250纳米/ 12.0，3分别为nM / 666.7（图2，B至D）。两种其他MEK抑制剂曲美替尼（43）和mirdametinib（44）以及ERK特异性抑制剂AZD0364（45）分别以100 nM / 40.0、500 nM / 6.0和5 nM / 200.0的IC 50 / TI给予了显着的顺铂保护（图2）。 ，E到H）。此外，FDA批准以1:80的摩尔比给药的dabrafenib和曲美替尼的组合常规用于治疗BRAF突变的癌症，因为它被证明可以有效增强BRAF途径的抑制作用并增加患者的生存率（18，33）。我们在亚最佳浓度的外植体模型中测试了这种组合，其中两种药物都不具有显着的保护作用，但是组合的化合物对顺铂诱导的OHC丢失具有显着的保护作用（图2G）。所有化合物的鬼笔环肽染色组织的共聚焦图像如图2所示。S2。请注意，对于所有在耳蜗外植体中用顺铂处理过的化合物，我们都观察到了高斯曲线：在低浓度下没有保护作用，在高浓度下，该化合物与顺铂组合对HCs有毒。在一起，这些数据进一步验证了BRAF及其下游效应子是预防顺铂诱导的耳毒性的治疗靶标。达布拉非尼的所有化合物均优于按IC 50进行测试的化合物（30 nM;图1D），除了RAF-265和AZD0364更有效外，但由于达布拉非尼的FDA地位，最佳TI（> 2000）和通过血脑屏障的通透性，我们继续使用该化合物用于体内测试。

图2 其他热门的BRAF和MAPK抑制剂可防止外植体中顺铂的耳毒性。

（A）推定的BRAF / MEK / ERK细胞途径和该途径中的小分子蛋白激酶抑制剂是我们内耳细胞系筛选中的热门药物，可防止顺铂诱导的细胞死亡。BRAF抑制剂vemurafenib（B），PLX-4720（C）和RAF-265（D）; MEK1 / 2抑制剂mirdametinib（E），trametinib（F）以及dabrafenib和trametinib的组合（G）; 和ERK1 / 2抑制剂AZD-0364（H）在耳蜗外植体培养试验中进行了测试，以防止顺铂引起的OHC死亡。单独使用培养基（黑色），单独使用顺铂（白色），单独使用化合物（绿色）或在将顺铂（150μM）添加至处理24小时（紫色）的P3 FVB耳蜗外植体之前1小时添加化合物。每个条中的数字表示每次处理计数的外植体数量。用鬼笔环肽染色计数每160μm耳蜗中转区域的OHC数量，平均值为±SEM，与单独的顺铂（红色）和单独的培养基相比，* P<0.05，** P <0.01，*** P <0.001 （黑色）通过Bonferroni事后测试进行单向方差分析。

此外，为了将达拉非尼与目前参与临床试验的其他药物进行基准比较，我们将其IC 50和TI与先前报道的使用相同P3 FVB外植体模型的化合物进行了比较。包括肯帕龙，STS，依布硒啉，D-蛋氨酸和地塞米松，其IC 50 / TI分别为0.2μM/ 150、2.1μM/ 285、10.8μM/ 1.4、98.4μM / 1.0和> 0.25μM/ 20。 （13，46）。相比之下，达拉非尼比所有其他化合物更有效且具有更大的TI，这表明它是成年小鼠进一步体内测试的极佳候选者。

达拉非尼可阻断顺铂诱导的MAPK磷酸化级联反应

由于达拉非尼是HEI-OC1细胞和耳蜗外植体中顺铂诱导的细胞死亡的有效抑制剂，因此我们接下来在这些模型中证明了BRAF及其下游靶点的顺铂激活。将HEI-OC1细胞用50μM顺铂处理（用于caspase-3 / 7筛选的浓度相同）处理30分钟，1小时和5小时，然后通过Western blot分析全细胞裂解液。发现顺铂随时间增加BRAF，MEK和ERK的磷酸化，从而使其活化，而在所有三个时间点的ERK磷酸化均显着增加（图3A）。然后用浓度递增的dabrafenib预处理细胞，使其IC 50分别达到1x，2.5x和5x。在HEI-OC1细胞中。用化合物处理细胞1小时，然后用50μM顺铂处理1小时，以确定dabrafenib通过Western blot阻断顺铂诱导的信号变化的能力。单独使用最高测试浓度的达布拉非尼治疗作为对照。尽管与对照细胞相比，顺铂再次增加了BRAF，MEK和ERK的磷酸化，但达拉非尼以剂量依赖性的方式减轻了这些变化（图3B）。

图3 达拉非尼减轻了顺铂激活的BRAF信号级联反应。

（A）在50μM顺铂处理30分钟，1小时和5小时后，HEI-OC1细胞中BRAF，ERK和MEK磷酸化的代表性Western印迹图像。将磷酸化的蛋白条带归一化为β-肌动蛋白，取平均值，即平均值±SEM，* P<0.05，** P <0.01，采用Bonferroni事后检验进行单向ANOVA。n =4。（B）代表性蛋白质印迹图像（n达拉非尼（14、35或75μM）和顺铂（50μM）在HEI-OC1细胞中联合处理后= 3）BRAF，ERK和MEK磷酸化。在进行1小时的顺铂处理之前，先用dabrafenib预处理细胞1小时。单独使用培养基，单独使用顺铂和单独使用75μM达拉非尼作为对照。将磷酸化的蛋白条带归一化为β-肌动蛋白，取平均值，用Bonferroni事后检验通过单向ANOVA进行±SEM，* P <0.05，*** P <0.001。Ñ = 3（Ç）代表性的鬼笔环肽（红色）和磷酸化ERK（pERK）（绿色）染色的P3 FVB整装中转小鼠耳蜗外植体经3μMdabrafenib（Dab）预处理1小时（共10分钟顺铂（150μM）暴露）的共聚焦图像。带有标记箭头的Deiters细胞（DC）和内指骨细胞（IPhC）。n = 6耳蜗。（D）代表性的鬼笔环肽（红色）和pERK（绿色）染色的P3 FVB整装中转小鼠耳蜗外植体用3μMdabrafenib（Dab）预处理10小时顺铂（150μM）暴露前的共聚焦图像。如下所示的邻区，其中OHC用白色箭头标识，内部HC（IHC）用黄色箭头标识，pERK阳性DC和IPhC用标记箭头标识。ñ = 6耳蜗。

因为在ERK中观察到信号的显着变化，所以用150μM顺铂处理P3-P4 FVB耳蜗外植体10分钟，30分钟和1小时，然后对鬼笔环肽和磷酸化ERK（pERK）进行染色。然后通过共聚焦显微镜对组织样品成像。在10分钟时观察到ERK的快速磷酸化，随后在30分钟和1小时时信号降低。值得注意的是，pERK信号最初是在SC中观察到的，尤其是Deiters'（DC）和内指骨细胞（IPhC）区域，而不是HCs，并传播到周围细胞中（图3C）。为了确定达拉非尼是否能阻止顺铂诱导的ERK活化，我们用3μM达拉非尼预处理了耳蜗外植体1小时，然后与顺铂接触10分钟。尽管未经处理的耳蜗表达低水平的pERK，但在DC和IPhC区再次观察到顺铂诱导的ERK磷酸化，而达拉非尼治疗阻止了ERK的活化（图3D）。）。为了验证顺铂处理后在SC中而不是在HC中是否激活ERK，我们将外植体与仅标记HC的肌球蛋白VIIa染色，并显示激活ERK的细胞与被HC特异性染色的细胞之间没有重叠标记（图S3）。综合起来，这些数据表明顺铂是MAPK磷酸化级联的有效诱导剂，而达拉非尼则减轻了顺铂激活途径。

达布拉非尼在体内可预防顺铂诱导的斑马鱼体内HC丢失

斑马鱼的侧线神经质是研究药物对顺铂或氨基糖苷毒性的保护的公认模型，因为它们的HC被认为与哺乳动物HCs同源，并且在体内容易被化合物吸收（47 – 49）。正如我们在之前的研究中，在检查MI1（内侧神经丘1）和O1-2（耳线）神经丘（：GFP brn3c）Tg的斑马鱼胚胎受精后5天（50，51）。幼虫先用dabrafenib预处理1小时，然后再用大剂量400μM顺铂（有或没有dabrafenib处理）进行6小时的处理，并在淡水中恢复1小时。绿色荧光蛋白（GFP）（brn3c）和otoferlin染色用于鉴定神经肥大HCs。在图。与仅使用控制二甲基亚砜（DMSO）的动物相比，仅用顺铂处理的S4幼虫表现出明显的HC损失，而与单独使用顺铂相比，用100 nM达拉非尼共同治疗的动物具有明显的HC损失。在所有测试浓度下单独使用达拉非尼的治疗均未显示毒性作用。因此，达布拉非尼在体内可预防顺铂诱导的斑马鱼体内HC死亡。

达布拉非尼在体内可预防顺铂引起的成年小鼠听力损失

当与其他MAPK抑制剂一起评估时，达布拉非尼在小鼠耳蜗外植体中显示出更高的效价和TI，此外，先前已在临床试验中对顺铂耳毒性进行了先前检查的化合物。因此，我们接下来在成年小鼠中测试了该药物。我们使用强饲法进行达拉非尼给药，因为这种方法在临床环境和一般人群中均易于使用。如图4A中所述，在实验程序前1周建立了P42 FVB小鼠的基线听觉脑干反应（ABR）阈值。小鼠预处理dabrafenib（100毫克/千克），三分之一的最高报道在小鼠每日无毒剂量并且与批准用于人类（每日剂量15，18，52），先前优化顺铂之前45分钟（30毫克/千克）腹膜内注射（13）。然后，在顺铂暴露后24和48小时给小鼠额外的dabrafenib剂量。顺铂注射后21天使动物恢复，并记录最终的ABR阈值。单独用载体或达布拉非尼治疗的小鼠没有明显的阈值变化或体重变化。顺铂治疗的动物在8位，16和32 kHz的频率，与先前的研究一致（已显著升高阈移13，34）。达拉非尼和顺铂共同治疗的动物阈值漂移明显降低，在16和32 kHz时平均降低14.9 dB。值得注意的是，dabrafenib在16 kHz（图4B和图 S8）。同样，在D14时，dabrafenib和顺铂联合治疗的小鼠在16 kHz时具有各种声刺激强度的ABR的波1振幅也比单独使用顺铂的小鼠高，并且在90 dB声压水平（SPL）时显着（图4C）。

图4 达拉非尼可预防顺铂引起的成年小鼠听力丧失，并且不抑制顺铂杀死肿瘤的功效。

（A）将dabrafenib和顺铂给予成年P42 FVB小鼠的时间表。（B）ABR阈值遵循（A）中的协议进行移动。未经处理的对照（灰色），仅顺铂（黑色），单独达巴非尼（浅紫色）以及达布拉非尼和顺铂（深紫色）。（C）距（B）16 kHz处ABR波1的振幅。（B和C）均值±SEM，* P<0.05，** P <0.01，与采用Bonferroni事后检验的双向ANOVA进行的单方顺铂比较。（D）代表性的肌球蛋白VI染色，分别来自单独的载体，单独的顺铂以及结合了dabrafenib（Dab）和顺铂治疗的小鼠的8、16和32 kHz耳蜗区域的共聚焦图像。（E）通过肌球蛋白VI染色计数每160μm在8、16和32 kHz耳蜗区域的OHC数；数据显示为平均值±SEM，*的P <0.05，***的P <0.001，采用Bonferroni事后检验进行双向ANOVA。（F）单独用载体，1小时顺铂处理的P42 FVB小鼠的代表性4'，6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）（蓝色），pERK（绿色）和Tuj1（红色）免疫荧光染色的耳蜗切片30 mg / kg）或dabrafenib（100 mg / kg）进行45分钟的预处理，然后进行1小时的顺铂治疗。右上角镶嵌了Corti地区器官的高倍放大图像。n＝ 3只小鼠。（G）用达布拉非尼预处理1小时，然后联合顺铂和达布拉非尼治疗48小时，对神经母细胞瘤和肺癌细胞系的细胞滴度-Glo细胞存活百分比。数据显示为平均值±SEM，与Bonferroni post hoc测试通过单向ANOVA进行比较，与单用顺铂相比，* P <0.05，*** P <0.001。n = 6。

如图4（D和E）所示，耳蜗的形态学分析显示，与对照组相比，单独用顺铂治疗的动物的OHC损失显着，在32 kHz区域观察到最大的损失，这与ABR阈值变化一致。在达巴非尼和顺铂联合治疗的动物中，OHC的损失受到限制，证明了该药的保护作用。在单独用达拉非尼治疗的小鼠中未观察到OHC损失。最后，在顺铂腹膜内给药后1小时，在成年FVB小鼠的耳蜗SC中观察到ERK磷酸化，并通过dabrafenib预处理减弱了磷酸化（图4F）。在内耳和支配HC的神经纤维束中的血管纹区域也观察到ERK磷酸化，而达拉非尼在体内的预处理下调了磷酸化作用（图4F）。因此，pERK免疫染色，ABR阈值测量和形态OHC计数强烈表明，达拉非尼的口服递送可防止顺铂治疗后耳蜗组织中的ERK磷酸化，并且对成年小鼠的顺铂引起的听力损失具有保护作用，而仅达拉非尼治疗则没有有毒作用。

达拉非尼不干扰顺铂的杀伤功效

尽管在多种模型中证明了达拉非尼可预防耳毒性，但在考虑将其用于临床之前，确定该药物是否干扰顺铂的杀肿瘤功效也至关重要。在临床环境中，顺铂用于治疗多种肿瘤类型，包括神经母细胞瘤和肺癌。因此，三种人类神经母细胞瘤细胞系IMR-32，SH-SY5Y和SK-N-AS，以及三种人类肺癌细胞系：SHP-77小细胞，H1155非小细胞和A549非小细胞细胞，用于确定达拉非尼是否影响顺铂的杀肿瘤能力。单独用达拉非尼预处理细胞1小时，然后用15μM顺铂（对于A549为200μM）加35μM达拉非尼处理（3x保护性IC 50）在HEI-OC1细胞中孵育48小时，然后通过Cell Titer-Glo测定其活力。单独的培养基，单独的顺铂和单独的dabrafenib处理的细胞用作对照，据报道存活率是与单独的培养基相比的存活百分比（图4E）。已发现达拉非尼对顺铂诱导的肿瘤细胞死亡没有抑制作用。事实上，达巴非尼在IMR-32和SHP-77细胞系中与顺铂联用会增加肿瘤细胞死亡。总之，这些数据表明达拉非尼不干扰顺铂的杀灭肿瘤的功效，并且在某些肿瘤中，它与顺铂协同作用可增加肿瘤细胞的死亡。

达布拉非尼可减轻成年小鼠体内噪声引起的听力损失

先前的研究表明，能够防止顺铂引起的听力损失的化合物也可以防止噪音引起的听力损失（13）。为了测试dabrafenib是否可以防止噪音引起的听力损失，我们使用了先前发布的协议，其中在建立基线ABR和DPOAE阈值后5至7天，小鼠在8至16 kHz的频率下暴露于100 dB的噪音八度频段持续2小时，这导致噪声暴露后14天观察到的永久性ABR和DPOAE阈值偏移30到50 dB（13）。在噪声侵害前45分钟，通过口服强饲法给实验动物达拉非尼（100 mg / kg），并在噪声暴露后24和48小时再给予两次剂量（图5A））。与单独使用载体相比，用达拉非尼治疗的动物的ABR阈值偏移明显更低，在三个测试频率下的平均保护为16.8 dB（图5B和图S8）。达巴非尼治疗的未暴露噪音的小鼠未表现出明显的阈值漂移，体重变化或一般行为。另外，尽管噪声降低了16kHz ABR波1的幅度，但达布拉非尼在80dB和90dB SPL时显着减轻了这种影响（图5C）。在一个类似的实验中，遭受噪声暴露的小鼠在8 kHz和16 kHz时DPOAE阈值偏移急剧增加，而达布拉非尼治疗则提供了显着的保护作用（图5D）。

图5 达拉非尼预处理可防止成年小鼠因噪音引起的听力损失。

（A）对成人P42 FVB小鼠施用达拉非尼的时间表和噪声暴露。（B）ABR阈值遵循（A）中的协议进行移动。达巴非尼无噪音暴露治疗（浅紫色），无噪音（黑色）和达巴非尼无噪音治疗（深紫色）。（C）距（B）16 kHz处ABR波1的振幅。（D）DPOAE阈值遵循（A）中的协议。携带者不接触噪音（灰色），达布拉非尼治疗不接触噪音（浅紫色），单独噪声（黑色）和达布拉非尼治疗不接触噪音（深紫色）。（B至D）均值±SEM，* P<0.05，** P <0.01，*** P与采用Bonferroni事后检验的双向方差分析相比，单独噪声<0.001。（E）在整个安装的小鼠耳蜗中，在16 kHz区域，代表性的Ctbp2点状（红色）和肌球蛋白VI（绿色）染色的IHC共聚焦图像。（F）计数每个IHC在16 kHz耳蜗区域的Ctbp2点数；数据显示为均值±SEM，* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001，采用Bonferroni事后检验进行单向ANOVA。n = 4耳蜗。（G）代表性的鬼笔环肽（红色）和pERK（绿色）免疫荧光染色的成年FVB小鼠耳蜗。按照来自（A）的方案，将小鼠暴露于噪音中，然后安乐死，并在噪音暴露后3小时进行耳蜗固定。下面的正交部分显示了用白色箭头标识的OHC，用黄色箭头标识的IHC，以及用标记箭头标识的pERK阳性DC和IPhC。n = 2耳蜗。

收集这些动物的耳蜗，并对肌球蛋白VI染色以进行形态分析。尽管没有观察到显著OHC损失，以前的研究报告中的突触色带其中内的HC（IHCS）形成与神经元纤维（突触联系的功能障碍噪声损伤导致53，54）。为此，对耳蜗进行染色以检测突触带状支架蛋白Ctbp2，以测量IHC在16 kHz区域的突触带完整性的丧失（图5，E和F）。与仅用达布拉非尼治疗且无噪声暴露的对照小鼠相比，仅接触噪声的单独携带者的小鼠每IHC的Ctbp2-点数明显减少。达拉非尼治疗可部分挽救小鼠的点状损失，其结果与16 kHz时ABR阈值偏移相关。此外，我们试图确定噪声刺激是否会引起耳蜗中ERK的磷酸化，这与顺铂损伤时观察到的相似。在对鬼笔环肽和pERK进行噪声暴露后立即和在3小时后对小鼠耳蜗进行染色后发现，噪声激活了SC（特别是DC和IPhC）中的ERK（图5G和图S5），与顺铂处理过的耳蜗的图像非常相似（图3， C和D以及4F）。达拉非尼预处理可减少这些SC中的ERK磷酸化（图5G）。因此，结合的ABR阈值移位数据和Ctbp2-puncta测量结果表明，dabrafenib预处理可对体内成年小鼠的噪声诱导的耳毒性提供明显的保护，并阻断MAPK途径的噪声激活。

dabrafenib和AZD5438的联合治疗可防止成年小鼠体内噪声暴露后的听力损失

噪声损伤并非总是可以预测的，因此预处理通常不是一种选择。因此，我们试图确定达布拉非尼在噪声暴露后给药时是否具有保护作用。为此，我们修改了之前的噪音实验规程（图5A），改为在噪音侵害后24、48和72小时给小鼠dabrafenib治疗（图6A）。同样，为了提高治疗效果，我们没有给小鼠每天100 mg / kg的一剂药物，而是每天两次两次，两次治疗之间8小时通过口服强饲法给予达拉非尼，因为该化合物有一半循环寿命大约8小时（55）。在该方案中使用达布拉非尼治疗可显着降低阈值漂移，在16 kHz频率下平均降低21.0 dB（图6B）。因此，数据表明达拉非尼在体内成年小鼠体内暴露于噪音后，可提供保护，防止噪音引起的听力损失。

图6 Dabrafenib和AZD5438后处理可防止成年小鼠受到噪音介导的听力损失。

（A）向成年P42 FVB小鼠施用化合物和噪声的时间表。（B）对照组和达布拉非尼（60 kg / mg）每日两次经口管饲的小鼠在100-dB 8至16-kHz八度频带噪声2小时后14天记录ABR阈值变化。达巴非尼无噪音暴露治疗（浅紫色），无噪音（黑色）和达巴非尼无噪音治疗（深紫色）。平均值±SEM，** P<0.01，与采用Bonferroni post hoc测试的双向ANOVA进行的单独噪声比较。（C）对照组和每日两次经口管饲的AZD5438（35 kg / mg）每天两次的小鼠在100-dB 8至16-kHz八度频带噪声2小时后14天记录ABR阈值变化。AZD5438不带噪声暴露的治疗（浅绿色），仅带噪声的治疗（黑色）和达布拉非尼带噪声暴露的治疗（深绿色）。与采用Bonferroni事后检验的双向方差分析相比，该值与单独的噪声相比并不显着。（D）对照和通过每天两次口服治疗的dabrafenib（60 kg / mg）和AZD5438（35 mg / kg）联合治疗的小鼠经100-dB 8至16kHz倍频程噪声2小时后14天记录ABR阈值变化管。达巴非尼和AZD5438治疗无噪音暴露（浅红色），仅噪音（黑），达布拉非尼和AZD5438治疗（深红色）。平均值±SEM，*** P 与采用Bonferroni事后检验的双向方差分析相比，单独噪声<0.001。

最近，我们确定了防止顺铂和噪音引起的听力损失（几个CDK2抑制剂13，34）。AZD5438是可口服生物利用的第二代CDK2抑制剂。因此，我们试图确定该化合物是否可以与达拉非尼联合使用，以增强抵抗顺铂和噪音引起的听力损失的保护作用（图S6A）。最初，我们在顺铂暴露的人工耳蜗外植体模型中测试了30 nM达拉非尼和0.34 nM AZD5438的组合，表明与单独使用每种药物相比，它提供了增强的保护作用（图S6B）。为了确保AZD5438和dabrafenib / AZD5438的联合治疗不会干扰顺铂的杀伤功效，对神经母细胞瘤和肺癌细胞株进行了测试（图S6C）。除了仅用于AZD5438的SKN-AS细胞系外，在所有测试的细胞系中，单独的AZD5438以及达拉非尼和AZD4538的联合治疗均不会干扰或增强顺铂介导的肿瘤细胞死亡。此外，使用经口管饲法递送的单剂量AZD5438（75 mg / kg）进行的小鼠预处理实验表明，AZD5438可以防止顺铂和噪音引起的听力损失（图S7，A至D）。但是，重复噪声后治疗实验后发现，经口管饲法每天两次递送的AZD5438（35 mg / kg）并未显着降低小鼠的ABR阈值变化（图6C）。

最后，我们试图确定达拉非尼和AZD5438的组合能否在噪声暴露后提供增强的保护。与单独携带者的小鼠相比，在噪声暴露后每天24、48和72小时每天两次用dabrafenib（60 mg / kg）和AZD5438（35 mg / kg）处理的小鼠表现出明显降低的ABR阈值变化，平均降低24.4 8、16和32 kHz频率下的dB。没有噪声暴露的对照达布拉非尼和AZD5438治疗的小鼠未表现出明显的阈值变化或体重/行为改变。总体而言，在所有测试频率下，与单独使用每种化合物相比，该治疗方案均可提供增强的，几乎完全的保护（图6D）。

讨论

在美国，噪声诱发的听力损失是第二大最常见的感觉神经性听力障碍形式，仅次于与年龄相关的听力损失（老年性耳聋）（56）。顺铂诱导的听力损失是化疗的患者40〜60％的不可避免的副作用与来自不同程度的听力损失（癌症患8，57）。鉴定在化疗期间和暴露于噪音后可以给予患者的药物，以保护和预防听力损失是迫切的医疗需求。

达拉非尼可预防顺铂和噪音损害

达夫拉非尼是一种BRAF特异性抑制剂，在我们的细胞系筛选中对顺铂诱导的细胞死亡表现最出色，并且在耳蜗外植体培养物中显示出离体保护，并且在斑马鱼侧线神经质和顺铂小鼠模型中显示出显着的体内保护作用。和噪音引起的听力损失。在这项研究中，我们使用了一次大剂量顺铂方案（30 mg / kg）作为小鼠中的原理证明，来测试dabrafenib对顺铂的保护作用。我们手中的这种一剂顺铂方案与低剂量的多药顺铂方案有很好的相关性（58），正如我们先前针对肯帕龙比较两种方案所显示的那样（13））。我们在可能导致FVB小鼠永久性听力丧失，100 dB SPL八度频段持续2小时的条件下测试了达布拉非尼的噪声防护，并且处于人们日常生活中常见的噪声损害范围之内。结合达布拉非尼在人类使用中的大量信息，我们的结果表明，它可以迅速用于人类的听力保护和治疗。

正如我们预期的那样，达布拉非尼穿过血迷宫屏障，通过口服给药对小鼠产生了观察到的作用。dabrafenib的这样的性质目前区别于许多其他候选人在临床试验中用于otoprotection（1，2，59）和进一步的结构活性研究将提供深入了解药物性质优选用于通过血-迷路屏障（60）。

达拉非尼不干扰顺铂杀死肿瘤细胞的功效

在这项研究中，我们测试了达拉非尼在两种代表性肿瘤类型中对顺铂杀伤功效的干扰，其中两种标准治疗均以顺铂作为一部分：小儿神经母细胞瘤和成年肺癌。我们发现在这些肿瘤的代表性遗传细胞系中，达布拉非尼不会干扰，在两种细胞系中，IMR-32和SHP-77甚至可以在防止小鼠听力损失的剂量下增强顺铂杀死肿瘤的功效。达拉非尼已被公认是一种有效的抗肺癌药物（18），并且如预期的那样，本研究中仅药物治疗就抑制了肺癌细胞的存活，并显着抑制了SHP-77细胞，并且在H115和A549中观察到了类似的趋势细胞（图4G）。AZD5438与顺铂共同处理不会干扰所测试的六个细胞系中五个细胞的顺铂杀伤功效，甚至可以显着增强对三个肿瘤细胞系的杀伤作用（图S6C）。在成神经细胞瘤SKN-AS细胞系中，AZD5438干扰了顺铂的杀伤能力，尽管与达布拉非尼联合使用时未测到干扰（图S6C）。根据达布拉非尼的化学结构及其对噪声耳毒性的保护作用，我们的证据表明它不直接干扰顺铂，而是通过BRAF细胞内信号传导起作用。达拉非尼的这种特性使其在目前的临床试验中具有优异的抗顺铂耳毒性保护作用，优于其他许多候选治疗药物。

达拉非尼在FDA批准的人类使用浓度下可防止顺铂和噪音引起的听力损失

在小鼠中观察到的保护剂量与批准用于人类的剂量相同。我们未观察到达拉非尼单独治疗3天的体重，一般外观/行为和长达21天的耳毒性对小鼠的全身毒性或耳毒性作用（图4和5））。达拉非尼长期以每天6到12个月的剂量（相当于小鼠的等效剂量）对人体给药时，会产生诸如发烧，关节痛，皮疹和乳头状瘤的副作用。因此，重要的是进一步确定人在短期内使用达布拉非尼的副作用，以及确定体内TI的小鼠最低有效剂量。此外，修改给药方案和配方将进一步提高达布拉非尼在临床上作为耳保护剂的临床潜力。正如我们在此处证明的针对噪音引起的听力损失的达拉非尼/ AZD5438的联合治疗，具有明显的优势，即允许使用每种剂量的较低剂量的药物，这些药物可减少不良副作用，而不会损害保护或治疗效果。

达拉非尼抑制SC中ERK激酶的磷酸化

达布拉非尼抑制一种新的耳蜗靶BRAF激酶及其相关的下游激酶MEK1 / 2和ERK1 / 2，以保护其免受顺铂和噪音诱导的细胞死亡，表明它们在有丝分裂后的耳蜗细胞中具有关键的促凋亡作用。我们观察到短时间内顺铂和耳蜗SC（尤其是DC和IPhC）中的顺铂和噪音损害均导致磷酸化ERK上调。这两种BRAF / MEK / ERK途径在重叠细胞中的损伤均上调，这不仅解释了为何同一药物可以保护免受两种来源的损害，而且进一步验证了我们的筛选方法能够识别出可防止两种损伤的药物。由于生长迟缓以及血管和神经元缺陷Wojnowski，小鼠BRAF的生殖系敲除导致E10.5至12.5之间的胚胎死亡等。（61）。生成其中BRAF在内耳细胞和/或耳蜗SC中特异缺失的小鼠模型，将进一步评估BRAF在有丝分裂后的耳蜗细胞中发挥促凋亡作用的机制。

近年来的一些研究表明，SCs在触发和传递耳蜗中的细胞死亡信号中起着重要作用。Lahne和Gale表明，在耳蜗外植体受到机械损伤或氨基糖苷新霉素的几分钟之内，胞浆中的磷酸化ERK在Deiters和指骨细胞中被瞬时激活，而在HCs中则未被激活（26）。前田等。（27）和Herranen等。（28）表明在2小时的120或105 dB倍频程噪声后，支持性耳蜗细胞中的核磷酸ERK信号被瞬时激活。我们的数据与以前的出版物相结合，表明在各种损伤（例如顺铂，噪音，氨基糖苷或机械损伤）后，细胞质中会立即激活pERK，并且pERK会在数小时后转移到细胞核中。已知ERK蛋白可穿梭至细胞核以发挥其活性（62）。此外，在成年的耳蜗中，我们观察到顺铂给药后1小时，达拉非尼下调的血管纹状体和神经纤维束支配HC的区域出现pERK染色（图4F）。以前的报告已经记录到纹和螺旋神经节神经元的顺铂诱导的损伤，增强这些细胞以顺铂处理（敏感63 - 66）。

我们的结果表明，细胞中pERK激活的下游目标可以调节核转录因子，从而增加分泌配体作为HCs向周围细胞的转录，从而影响其存活。从死亡途径前庭旺抗生素侮辱后分泌的热休克蛋白HSP70的保护作用已经被报道（67，68）。ERK激酶上调了几个有丝分裂后细胞系统中应激反应途径中涉及的热激蛋白（69）。此外，ERK磷酸化可以触发在耳蜗的免疫应答，并可能有助于活化巨噬细胞募集到受损区域（28，70）。因此，我们的研究表明，BRAF / MEK / ERK和CDK2途径是HSP70和巨噬细胞募集的上游调节剂，以介导其在有丝分裂后细胞中的应激活化作用。

抑制BRAF在有丝分裂后细胞中的保护机制

当在肿瘤细胞中激活时，BRAF / MEK / ERK途径通常与细胞增殖和存活有关。相反，在耳蜗有丝分裂后细胞中，达布拉非尼对BRAF途径的抑制作用可减少细胞死亡并提高细胞存活率，如此处所示。CDK2抑制剂，我们在类似屏幕先前鉴定也显示在有丝分裂后细胞耳蜗保护而这两个BRAF抑制剂和CDK2抑制剂在肿瘤细胞（抗增殖化合物的两种已知的基团13，34）。对于ARAF（RAF-1），BRAF的家庭成员，在保护免受凋亡刺激细胞角色已在内皮细胞和心肌细胞有丝分裂后细胞前所示，尽管这些通路是独立的MEK激酶（71，72）。因此，我们建议BRAF / MEK / ERK和CDK2在有丝分裂后细胞中发挥促凋亡作用，同时在肿瘤细胞中发挥促增殖作用。这些途径如何在上游应激时被激活，以及它们的药理抑制作用如何减轻有丝分裂后细胞下游的凋亡，还有待探索。在有或没有顺铂或噪声暴露的情况下，可以使用体内药物遗传学干预措施进一步分析BRAF / MEK / ERK和CDK2之间的上位性及其途径。

口服达拉非尼和AZD5438的治疗潜力

总之，我们的研究提供了将达布拉非尼重新用作候选药物来预防顺铂和噪声引起的听力损失的关键结果。dabrafenib与AZD5438的组合即使在暴露于噪音下24小时后仍可提供全面保护。我们的结果的基础上，dabrafenib也可为在内耳（抗生素诱发的和年龄相关性听力损失测试2，6，59，73，74）。我们的研究有望导致首批经过FDA批准的专门用于听力保护的药物（75）。我们还提供证据表明，BRAF / MEK / ERK和CDK2途径虽然在肿瘤细胞中起关键作用，但在有丝分裂后的耳蜗细胞中发挥促凋亡和应激激活的作用，这是有丝分裂后细胞中这些途径的不足的特征。结果，达拉非尼也可能用于治疗患有肾脏和大脑有丝分裂后细胞的退行性疾病。在治疗帕金森氏病的硅药物筛查中，达拉非尼最近获得了最高评价（76）。

材料和方法

伦理声明

所有动物程序均已由Creighton大学机构动物护理和使用委员会和Boys Town国家研究医院批准。

鼠标型号

FVB繁殖小鼠购自杰克逊实验室（Jackson Laboratory），在Creighton University动物设施中饲养，用于噪声破坏和顺铂治疗实验。通过腹膜内注射Avertin（500 mg / kg）（2,2,2-三溴乙醇，T4，840-2; Sigma-Aldrich）麻醉动物，并通过脚趾夹捏确定完全麻醉。在整个实验过程中，将麻醉过的动物放在加热垫上以保持体温，直到醒来。

斑马鱼模型

斑马鱼（Danio rerio）品系Tg（brn3c：GFP）是通过成年鱼成对交配而获得的，这些成年鱼是由机构动物保育和使用委员会批准的标准方法，在成男孩镇国家研究医院饲养的。

细胞系

分别发现了三种人类神经母细胞瘤细胞系IMR-32，SH-SY5Y和SK-N-AS，以及三种人类肺癌细胞系SHP-77小细胞，H1155非小细胞和A549非小细胞。用于确定化合物对顺铂杀伤肿瘤的作用（77 – 83）。细胞系购自美国典型培养物保藏中心（ATCC），并根据ATCC规范进行细胞培养。神经母细胞瘤细胞系IMR-32和SH-SY5Y维持在Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM）中，葡萄糖（4.5 g /升）1X-谷氨酰胺和丙酮酸钠（10-013-CV，康宁）加入10％胎牛血清（FBS）（35011132，康宁）和氨苄西林（50μg/ ml; A5354-10ML，Sigma-Aldrich）。将SK-N-AS细胞系维持在DMEM 1x中，含D-葡萄糖（4.5 g /升），L-谷氨酰胺和25 mM Hepes（12430-054，Gibco），含10％FBS和0.1 mM非必需氨基酸，并加入氨苄西林（50μg/ ml）。将A549细胞维持在添加有10％FBS和氨苄青霉素（50μg/ ml）的1-谷氨酰胺（30-2004，ATCC）的F-12K培养基中。将SHP-77和H1155细胞系保存在RPMI 1640（30-2020，ATCC）中，添加5％FBS和氨苄西林（50μg/ ml）。所有肿瘤细胞系均在37°C和5％CO 2下生长并使用0.05％胰蛋白酶-EDTA 1×（25300-054，Gibco）传代。HEI-OC1细胞系（12 – 14）保持在DMEM 1x中，葡萄糖（4.5 g /升），1-谷氨酰胺和丙酮酸钠（12430-054，Gibco）含10％FBS，氨苄西林（50μg/毫升），然后加入250微升γ-干扰素。这些细胞在允许的温度33°C和10％CO 2下培养，并使用0.05％胰蛋白酶-EDTA 1x传代。对于HEI-OC1细胞，在实验步骤前24小时，应从培养基中去除γ-干扰素以限制细胞生长。

基于细胞的caspase-3 / 7活性和Cell Titer-Glo活力HTS可防止顺铂诱导的细胞死亡

在这些筛选中，选择caspase-3裂解作为指示顺铂诱导的细胞凋亡的终点，因为它允许在HEI-OC1细胞中caspase-3裂解上游的任何分子靶标水平监测细胞死亡的抑制作用线。将细胞以事先优化的每孔1600个细胞的浓度接种在不含γ干扰素的培养基中，以限制增殖，并根据先前的剂量反应曲线针对50μM顺铂进行测试。将被测化合物溶解在DMSO中，然后添加到最终DMSO浓度<0.5％的培养基中。屏幕是以细节在我们以前的出版物（描述12，13）。Pifithrin-α被选定为所述屏幕的参照化合物，因为它通过抑制胱天蛋白酶3切割与IC提供针对顺铂耳毒性的良好保护50 7.7μM（图S1）的（5，12，84）。将Pifithrin-α添加到每个平板中作为筛选质量控制。验证了Caspase-Glo 3/7（Promega）测定法的线性度，该测定法能够测量因caspase-3 / 7裂解而发出的光并且适用于HTS，并且已验证0.5％DMSO具有对细胞死亡动力学没有影响。以1nM至85μM的最终浓度一式三份筛选化合物，并孵育22小时。Caspase-Glo 3/7分析定义了100％caspase-3 / 7活性，因为单独用顺铂处理的细胞和单独用培养基处理的细胞分配了0％caspase-3 / 7活性。命中定义为在50μM顺铂存在下可使caspase-3 / 7活性降低50％或更多的化合物。化合物的毒性通过单独的化合物单独的可行性测定Cell Titer-Glo（Promega）进行了测试（12）。蛋白质的数据集激酶筛选在已沉积抑制剂https://data.mendeley.com/datasets/yz9rbxyksf/1，DOI：10.17632 / yz9rbxyksf.1。

肿瘤细胞滴度-Glo活力测定

首先将细胞铺在96孔板中，然后在37°C的5％CO 2中附着过夜。第二天，癌细胞仅用化合物预处理1小时，然后用15μM顺铂（对于A549为200μM）加上化合物处理48小时，然后通过Cell Titer-Glo（Promega）进行分析以测量生存力。单独培养基，单独顺铂和单独药物处理的细胞用作对照，据报道存活率是与单独培养基相比的存活百分比。使用了达布拉非尼（35μM）和AZD5438（2.1μM），是caspase-3 / 7 HTS中针对顺铂的保护性IC 50的三倍。

耳蜗外植体

将P3-P4 FVB小鼠耳蜗解剖并在培养皿中的培养皿中保持过滤，该培养皿上装有1 ml生长培养基DMEM（12430-054，Gibco Life Technologies）和1％FBS（16000-044，Gibco Life Technologies） ，B-27补充剂（200μl/ 500 ml; 17504-44，Gibco Life Technologies），N-2补充剂（100μl/ 500 ml; 17502-048，Gibco Life Technologies）和氨苄青霉素（50μg/ ml; A5354过滤器（Millicell，PICM03050，Millipore）内外的-10ML，Sigma-Aldrich。人工耳蜗外植体培养1天后，添加有或没有测试化合物的生长培养基，在37°C的5％CO 2中孵育1小时。，然后与150μM顺铂（479306，Sigma-Aldrich）在有或没有受试化合物的情况下在生长培养基中于37°C孵育24小时。根据50、100、150和200μM顺铂的剂量反应选择150μM的顺铂浓度，并且由于外植体试验一致显示，在此浓度下，小鼠耳蜗中约40％的OHC在24小时后死亡小时（图1D和2，B至H）。用4％多聚甲醛固定耳蜗，并用Alexa Fluor 568鬼笔环肽对F-肌动蛋白染色以确定HCs的活力。通过共聚焦显微镜对耳蜗进行成像，拍摄来自中间弯道的两个160μm区域，并计算完整HC的数量。对于每种实验条件，测试了2至5个独立的耳蜗。注意，IC 50 dabrafenib在体外外植体培养是400倍更好比IC 50在内部细胞系测量并且可以归因于所存在仅在耳蜗外植体培养的细胞特异性受体的药物。这不是达拉非尼所独有的，在本研究和我们以前的研究中，所有热门药物都观察到了这一点（图2和表S1）（13）。

斑马鱼侧线

斑马鱼（D. rerio）的任何性别的实验幼虫都是通过在Boys Town国家研究医院饲养的成年鱼配对交配而获得的。我们使用了斑马鱼系Tg（brn3c：GFP）在HCs中表达膜结合的GFP。将鱼维持在28.5°C的E3培养基中[5 mM NaCl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl 2和0.33 MgSO 4（pH 7.2）]，密度为每100 mm 2培养皿50个胚胎/幼体。在受精后5天使用实验动物，并在治疗后和固定前冷冻麻醉。我们的研究中的平均HC计数是从以下三个神经质获得的：MI1（中枢神经母细胞1）和O1和O2（麻痹线）。

小鼠顺铂治疗

将十毫克的顺铂（479306，Sigma-Aldrich）粉末在37°C的10 ml无菌盐水（0.9％NaCl）中溶解40至60分钟。通过腹膜内注射以30 mg / kg的顺铂向FVB小鼠给药。顺铂注射前一天，小鼠通过皮下注射接受1 ml生理盐水。为了改善顺铂注射后的脱水，每天两次注射1 ml温盐水，至少7天，或者直到体重开始恢复为止。将经顺铂治疗的小鼠的笼子放在加热垫上至少7天，或直到体重开始恢复。每天至少提供7天新鲜糊状食物。顺铂和顺铂联合达拉非尼治疗均观察到50％的存活率。

通过管饲法给予化合物

化合物甲磺酸达拉非尼（HY-14660A）和AZD5438（HY-10012）购自MedChemExpress，并通过管饲法施用于FVB小鼠。将化合物溶解在10％DMSO，5％Tween 80（P1754，Sigma-Aldrich），40％PEG-E-300（91462-1KG，Sigma-Aldrich）和45％0.9％盐水的混合物中。对于顺铂和噪音预处理方案，在耳毒性损伤之前45分钟，对小鼠进行dabrafenib（100 mg / kg）和AZD5438（75 mg / kg）的初始治疗，并在损伤后24和48小时进行后续治疗。对于噪音后处理方案，化合物治疗分别在噪音损害后的24、48和72小时间隔内，分别在8天内分别以dabrafenib（60 mg / kg）和AZD5438（35 mg / kg）进行两次治疗。

ABR阈值和Wave 1幅度测量

ABR在小鼠中对于左耳测定稍作修改（先前所描述的13，34）。简而言之，通过使用位于颅骨，耳廓下方和尾巴底部的皮下针，在一个声音室（工业声学公司）中记录ABR波形，并将响应输入到低阻抗Medusa数字生物中放大器系统（RA4L; TDT; 20 dB增益）。在每个频率处，当电响应刚好在本底噪声之上时，以10 dB的步长将刺激强度从90 dB降低至0 dB，以确定阈值分贝SPL。ABR波形是对500个音频突发响应的平均值。记录的信号由300 Hz至3 kHz的带通滤波器滤波。在所有治疗前1周采集成年FVB小鼠（6周龄）的治疗前ABR记录，并在顺铂治疗后21天或噪声暴露后14天记录治疗后ABR的测量值。ABR阈值由五个波形峰中的三个或三个以上的任何一个确定。在所有测试频率下，用于实验的小鼠的基本ABR阈值在10至40 dB之间。所有阈值和位移均由两名实验者分别为每只小鼠确定。测量各个ABR波1的振幅，作为正峰值与随后的负谷之间的差。

老鼠的噪音暴露

将小鼠放在定制的丙烯酸室中的各个笼子中。声音刺激是由System RZ6（TDT）设备产生的，并使用75A功率放大器（Crown）进行了放大。声音通过扬声器喇叭（JBL）传递到丙烯酸室。SPL使用1/4英寸自由场麦克风（PCB）进行了校准。在进行实验性噪声暴露之前，使用1/4英寸麦克风对腔室内笼的四个象限进行采样，以确保在测量位置上，SPL的变化<0.5 dB。然后将成年小鼠暴露于100 dB的2小时八度音带噪声（8至16 kHz）。

组织制备和免疫荧光

从成年小鼠耳蜗制备和检查如（先前所描述的85，86）。所有图像均用共聚焦显微镜（LSM 700或710，Zeiss）采集。样品用鬼笔环肽（A12379或A12380，Invitrogen）或其他标记的抗体染色。使用了以下一级抗体：抗肌球蛋白VI（1：400； 25-6791； Proteus Bioscience），抗肌球蛋白VIIa（5μg/μl； 138-1-s，发育研究杂交瘤银行），抗Tuj1（ 1：250； 801201，BioLegend），抗pERK（1：400； 9101S，细胞信号技术）或抗Ctbp2（1：500； 612044，BD转导）。抗兔Alexa Fluor 488（1：400; A11034）和抗小鼠Alexa Fluor 647（1：400; A31571）二抗购自Invitrogen。使用具有4'，6-diamidino-2-phenylindole（P36941，Invitrogen）的ProLong金抗褪色剂对细胞核进行染色。

Ctbp2染色和定量

Corti器官被抗Ctbp2和抗肌球蛋白VI抗体染色。使用具有63倍物镜的Zeiss 700扫描共聚焦显微镜进行共聚焦成像。使用ZEN 2009或ZEN 2012软件（Zeiss）进行可视化和投影。使用以前报告的ZEN 2009或ZEN 2012三维构造函数，对重建后的三维图像上的Ctbp2点进行可视化和计数（54）。从实验组中随机选择了两只无噪声的达布拉非尼单独治疗的FVB小鼠的耳蜗，以及四只受到噪声的载体和四只经达布拉非尼治疗的FVB小鼠的耳蜗，从实验组中随机选择，用于量化Ctbp2点。在16 kHz耳蜗区域附近采集图像，每个图像包括12到18个IHC，量化为Ctbp2点的总数除以每个图像的IHC总数。

免疫印迹

加入蛋白酶（cOmplete ULTRA Tablets 05892791001）和磷酸酶（PhosSTOP 04906845001）抑制剂（Roche）后，在裂解缓冲液（9803，Cell Signaling Technology）中制备HEI-OC1细胞的完整裂解物。将裂解物在4°C下以15,000 g离心10分钟，并收集上清液。用BCA蛋白测定试剂盒（23235，Thermo Fisher Scientific）确定蛋白溶液中的蛋白浓度。将40微克的总细胞裂解液上样至4％至20％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上。以下抗体用于免疫印迹分析：抗BRAF（14814S），抗pBRAF（丝氨酸445，2696S），抗ERK1 / 2（4695），抗磷酸化ERK1 / 2（苏氨酸202 /酪氨酸204，9101S），抗MEK1 / 2（9122S）和抗pMEK1 / 2（Ser 217 /221，41G9S）购自Cell Signaling Technologies，抗β-肌动蛋白（C4; SC-47778）购自Santa克鲁兹 抗体以1：500至1：1000的稀释度使用。抗小鼠（P0447）和抗兔（P0448）二抗购自Dako Laboratories，并按1：5000稀释。使用美国国立卫生研究院（NIH）的ImageJ软件量化条带强度，并记录为与上样对照β-肌动蛋白的比值。每个Western blot系列（n）使用来自单独实验的细胞裂解液进行。使用NIH ImageJ软件定量印迹强度。

统计分析

通过使用Prism（GraphPad软件）进行统计。如果仅比较了两个条件，我们使用Bonferroni post hoc检验进行单向或双向方差分析（ANOVA）或采用两样本Student t检验。